Biotecnologie, Indirizzo Agrario)

Caratteristiche chimiche dei virus vegetali: composizione chimica delle proteine e tipi di struttura , caratteristiche chimiche degli acidi nucleici virali, tipi e strutture ; componenti minori ( carboidrati, lipidi, poliammine ecc.). Assemblaggio dei componenti nelle particella virale. Caratteristiche fisiche delle particelle virali e loro determinazione: massa ( coefficienti di sedimentazione e diffusione) , forme dimensioni e strutture.

Sistematica dei virus vegetali : criteri di classificazione in famiglie, sotto-

gruppi, generi e specie.

Variabilità dei virus: distinzione di ceppi o varianti , mutanti , ricombi-

nanti e forme .

Genetica dei virus vegetali : geni o cistroni essenziali e loro funzioni. Tipi di genomi virali: a RNA e DNA, singola o doppia elica, positivi e negativi ,monopartitici e pluripartitici.

Caratteristiche fisico-chimiche e genetiche dei virus difettivi ( DI) , dei virus-satelliti, RNA-satelliti e viroidi.

Patogenesi delle malattie virali: Inoculazione nella cellula ospite. Replicazione all’interno della cellula (fasi) : strategie di replicazione dei virus a genoma ss-RNA(+) mono e pluripartitico ( trascrizione, traslazione, assemblaggio) e dei virus con altri tipi di genomi( ss-RNA(-) ,ds-RNA, ss-DNA ,ds-DNA). Replicazione dei virus difettivi, viroidi, virus satelliti e RNA satelliti. Traslocazione ( diffusione) all’interno dell’ospite : a corta (proteine di movimento) e a lunga distanza( diffusione parenchimatica, floematica, parenchimatico-floematica).

Fisiopatologia della pianta virosata: modificazioni del metabolismo degli acidi nucleici, proteine, carboidrati ,ormoni , produzione di nuove sostanze ad azione antivirale( fattori antivirali=AVFs ; inibitori della replicazione= IVR) o correlate all’infezione virale( PR-protein, ecc). Modificazioni delle principali funzioni: fotosintesi, respirazione , traspirazione , assorbimento radicale.

Principali sintomatologie virali e modificazioni di portata citoistologica. Modificazioni submicroscopiche nella cellula virosata : degenerazioni degli organelli ,inclusioni amorfe e cristalline, virali e non, che accompagnano l’ infezione virale.

Eziologia delle infezioni virali. Trasmissione diretta (per polline, seme, contatto, parti di pianta) e trasmissione indiretta per vettori vegetali (crittogame) e animali( nematodi, aracnidi e insetti) e tipi di rapporti virus -vettori.

Isolamento e purificazione dei virus vegetali: metodi fisici, chimici, elettroforetici, ecc. Identificazione e caratterizzazione dei virus vegetali( diagnostica) : caratterizzazione chimico-fisica (assorbimento in UV, microscopia elettronica) , sierologica ( prepazione antisieri e tipi di tests sierologici) , con sonde nucleari e con uso di PCR.

Rapporti virus-pianta ospite-altri patogeni : suscettibilità e resistenza ,antagonismo e sinergismo, premunità , reazioni di difesa della pianta (tolleranza, ipersensibilità, resistenza sistemica acquisita). Caratteristiche e meccanismo di azione dei fattori antivirali( AVFs) e di altri inibitori proteici prodotti dalla pianta come risposta all’infezione virale.

Profilassi e terapìa delle infezioni virali: selezione di piante sane, uso di premunità e resistenza acquisita; utilizzazione di coltura di meristemi, termoterapia e chemioterapia per il risanamento di materiale infetto. Cenni di miglioramento genetico coi normali metodi di breeding (ereditarietà della resistenza ai virus). Produzione di piante transgeniche resistenti alle infezioni virali con metodi di ingegneria genetica; criteri per la costruzione di geni di resistenza: uso del CP e di altri geni del genoma virale, come tali o modificati , dei satelliti, di RNA antisenso o difettivi, di ribozimi ,ecc.. Amplificazione dei geni in appositi vettori e loro trasferimenti alle piante per via diretta( elettroporazione, cannoni biolistici ecc). , o indiretta con l’impiego di Agrobacterium spp. ingegnerizzati con vettori binari, o di virus. .Ottenimento delle piante transgeniche, metodi di rilevamento dell’avvenuta trasformazione e criteri di determinazione della resistenza alle infezioni virali. I virus vegetali come vettori genici di espressione transitoria per lo studio di geni virali e non.

Principali tipi di virosi delle piante coltivate, con particolare riguardo a quelle causate dal virus dell’accartocciamento della patata ( PLRV luteovirus) , del mosaico del cetriolo ( CMV cucumovirus) , della rizomania della bietola ( BNYVV furovirus) , del nanismo ruvido del mais ( MRDV reovirus), dello Sharka delle drupaceee ( PPV potyvirus), dell’arricciamento della vite ( GFV nepovirus)

Testi consigliati:

MATTHEWS R.E.F. .Plant virology, 3rd edition, Academic Press, New York-London , 1991.

BRUNT A.A. et al., . Viruses of plants. CAB International, 1996.

FRASER R.S.S.. Recognition and response in plant-virus interaction , NATO Series H: Cell Biology Vol. 41, Springer-Verlag, Berlin,Heidelberg, 1990.

MURPHY F.A.et al. . Virus taxonomy, Sixth report of the international

Committee of Taxonomy of Viruses. Springer-Verlag, Wien-New York,

1995

AUTORI VARI. Le virosi delle piante da frutto, l’Italia Agricola 122, 2, REDA , Roma ,1983.

AUTORI VARI. Le virosi delle piante ortive , l’Italia Agricola 120, 1, REDA , Roma 1983.

Inoculazione di ospiti differenziali , preparazione di griglie per microscopia elettronica col metodo "dip "per la visualizzazione diretta dei virus allungati al microscopio elettronico ,osservazioni al microscopio elettronico dei virus e dei tessuti vegetali virus-infetti.

Purificazione dei virus con metodo chimico fisico ( uso di solventi organici e centrifugazione differenziale) e determinazione degli spettri di assorbimento in UV con calcolo dei rapporti di assorbimento caratteristici.

Estrazione diretta dalle piante di RNA virale, sintesi di cDNA relativo a tutto il genoma( con random primers) o a geni specifici dello stesso, es. CP ( con primers specifici ), amplificazione con primers specifici a mezzo PCR ( polymerase chain reaction ). Elettroforesi su gel di agarosio degli amplificati da PCR e di plasmide tagliato opportunamente per l’inserzione, prelievo, purificazione e ligasi del vettore e del gene . Trasformazione di E. coli col plasmidio ricombinante , piastratura e selezione delle colonie trasformate su appositi substrati di coltura.

F.M. AUSUBEL et al. Current protocols in Molecular Biology . John Wiley 1 Sons, Inc., 3 vol. dal 1995 ,viene continuamente aggiornato.

J.M. BECKER et al. Biotecnology. A Laboratory course, 2nd ed. Academic Press, San. Diego-New York, 1996

T.A BROWN. Essential Moleculare Biology. A practical approach ,Vol 1 e 2, Oxford press , Oxford New-York, 1991.

SAMBROOK et al. Molecula Cloning, a laboratory manual,Vol 1 2,3 ,2nd ed. Cold Spring Harbor lab. Press, 1989.