AA 2000-2001

GENETICA MOLECOLARE I

Docente: Giuliano Della Valle

Indirizzo: Tutti

Tipo: 25 ore. II anno. II semestre

Contenuto del corso:

ORGANIZZAZIONE DEL GENOMA NEGLI ORGANISMI EUCARIOTICI: Associazione, ricombinazione e costruzione di mappe genetiche; analisi del cariotipo umano; tecniche di bandeggio dei cromosomi. Tecniche di mappatura dei geni sui cromosomi umani: ibridi cellulari somatici, separazione fisica dei cromosomi, ibridazione in situ. Correlazione tra mappe genetiche e citologiche; dimensioni e complessità del genoma. Distribuzione dei geni e delle sequenze ripetitive (intersperse e organizzate in tandem) nel cromosoma. Natura molecolare delle bande cromosomiche e loro significato funzionale, relazione tra tempi di replicazione del DNA nella fase S, espressione genica e bande cromosomiche.

CARATTERISTICHE FUNZIONALI DEI CROMOSOMI EUCARIOTICI: Isolamento e struttura e funzione di sequenze centromeriche; isolamento, struttura e funzione di sequenze telomeriche; saggi funzionali per sequenze centromeriche, telomeriche e origini di replicazione del DNA; strategie per la costruzione di cromosomi artificiali e utilizzo dei cromosomi artificiali di lievito per il clonaggio di estesi frammenti di DNA; vettori navetta.

MARCATORI MOLECOLARI DELL'ANALISI GENETICA:

Polimorfismi della sequenza del DNA: polimorfismi dei siti di restrizione (RFLP); sequenze micro- e minisatelliti (VNTR). Analisi e applicazioni del profilo genetico individuale (l'impronta genetica). Strategie per l'identificazione di geni malattia e loro clonaggio.

LE BASI GENETICHE DELLA TRASFORMAZIONE TUMORALE: Evoluzione genotipica della cellula tumorale; i geni soppressori della crescita tumorale; strategie per la loro identificazione e clonaggio; strategie per l'isolamento di oncogeni cellulari; meccanismi di attivazione degli oncogeni cellulari; ruolo degli oncogeni e dei geni sopressori della crescita tumorale.

CONTROLLO GENETICO DELLO SVILUPPO IN DROSOPHILA MELANOGASTER: La Drosophila Melanogaster come organismo modello per lo studio delle prime fasi dello sviluppo animale; isolamento e importanza dei mutanti; contributo dei prodotti di geni materni nella determinazione degli assi corporei; l'importanza dei gradienti d'informazione genetica per lo sviluppo dell'embrione; modelli di regolazione dell'espressione genica a cascata e determinazione dell'identità cellulare nei compartimenti corporei; geni omeotici: esempio di loci complessi finemente regolati che determinano la struttura dei segmenti.

Testi per consultazione:

HUMAN MOLECULAR GENETICS. Strachan T. and Read A.P. (II edizione 1999)

GENES VI (in alterantiva GENES V o VII). Benjamin L., Oxford University Press.

GENETICA GENERALE E UMANA vol I e II. De Carli et al. Piccin editore (1998).

MOLECULAR CELL BIOLOGY Lodish H et al. Editore Freeman (quarta edizione, 2000)

AA 2000-2001

GENETICA MOLECOLARE II

Docente: Giovanni Perini

Indirizzo: Tutti

Tipo: 25 ore. II anno. II semestre

Contenuto del corso:

PROGETTO GENOMA: Criteri per l' organizzazione di un progetto genoma. Approcci molecolari per la caratterizzazione di un genoma. Costruzione di mappe genetiche (marcatori polimorfici, STS EST microsatelliti) e fisiche (YAC, BAC, Cosmidi etc.).Metodi e strategie di sequenziamento.Costruzione di mappe trascrizionali: metodi analizzati. Genomi presi in esame. S. cerevisiae (accenni),C. elegans, D. melanogaster; H. sapiens.

GENOMICA FUNZIONALE: Generazione di mutanti funzionali in cellule e organismi. Tecniche di trasferimento del DNA in cellule in coltura (trasfezione transiente, selezione di cloni stabili, vettori plamidici, vettori virali, vettori reporter). Gene targeting nel lievito. Tecnica del "RNA interference" in C. elegans. "Gene targeting nel topo ( topi trangenici, knock-out, knock-in, knock out condizionali).Tecnica del "phage display" per lo studio di interazioni fra proteine. Utilizzo della tecnica di RNA/DNA Selex per l' identificazione di sequenze riconosciute da fattori trascrizionali o da fattori coinvolti nel processamento del RNA. Tecniche di analisi globale della regolazione genica (microarrays di cDNA, microarrays di peptidi, "two hybrid system" in lievito).

DETERMINAZIONE DEL SESSO NEI MAMMIFERI: Definizione di determinazione del sesso e differenziamento sessuale. Differenziamento sessuale negli embrioni maschili e femminili. Ipotesi del ruolo attivo del cromosoma Y nella determinazione del sesso maschile. Analisi nell' uomo della sindrome di Turner e di Klinefelter. Analisi di casi sia in topo che uomo con sindromi da reversione del sesso. Ipotesi dell' esistenza di un gene TDF/SRY (testis determining factor) e approcci sperimentali per l'identificazione di TDF/SRY. Caratteristiche strutturali e funzionali di SRY e dimostrazione che SRY e' necessario e sufficiente per la deteminazione del sesso maschile nei mammiferi. Altri geni coinvolti nel differenziamento sessuale :SOX9, SOX3, SF-1, AMH recettore per il testosterone e DAX-1 (ruolo nel sesso femminile). Regolazione temporale e sesso specifica dei geni coinvolti sia nella determinazione che nel differenziamento sessuale: proposta di un modello a cascata.

INATTIVAZIONE DEL CROMOSOMA X: Compensazione del dosaggio genico in D. melanogaster e mammiferi. Corpo/cromatina di Barr. Ipotesi di Mary Lyon: inattivazione casuale del cromosoma X. Casi in cui l'inattivazione non e' casuale. Fasi di inattivazione del cromosoma X. Riattivazione del cromosoma X inattivo nella linea germinale femminile. Caratteristiche strutturali del cromosoma X inattivo. Identificazione del Centro di Inattivazione (XIC). Identificazione di XIST e suo ruolo nel meccanismo di inattivazione.

IMPRINTING GENOMICO: Esperimento di Surani e Solter (1980). Esperimenti di Searly and Beechey (1982-1985).Non equivalenza dei due genomi parentali: analisi di disomie uniparentali nel topo. Meccansimi generativi di disomie uniparentali: traslocazioni robertsoniane e non disgiunzione cromosomica alla meiosi.Definizione di imprinting genomico. Scoperta. del primo gene soggetto ad imprinting: Igf2 (1991). Metodi per identificare geni "imprinted".Caratteristiche dei geni "imprinted". Tempo e luogo dell'azzeramento del marchio di imprinting nella linea germinale. Marchio di imprinting: la metilazione. Stato di metilazione dei geni imprinted di origine materna o paterna. Ruolo della metilazione nell imprinting. Sindromi ereditarie che segregano secondo un modello di imprinting parentale: sindrome di Prader-Willi e sindrome di Angelman. Ipotesi sul ruolo dell'imprinting genomico nell' evoluzione dei mammiferi.

MECCANISMI DI ESCLUSIONE/REPRESSIONE ALLELICA: Esclusione allelica a carico dei geni delle immunoglobuline (Ig HC e Ig LC). Repressione allelica a carico dei geni codificanti per i recettori olfattivi. Ipotesi sui meccanismi molecolari alla base dei due fenomeni.