Strutture e funzioni della cromatina.

Condensazione genomi virali. Organizzazione gerarchica della cromatina e dei cromosomi. Eucromatina ed eterocromatina. Nucleosoma e istoni del core. Fibre di 10 e 30 nm. Uso delle nucleasi per lo studio della cromatina. Posizione dei nucleosomi lungo il DNA. Siti di ipersensibilita' alla DNasi I ed acetilazione degli istoni. Ruolo dell'istone H1. Cromatina repressa e funzioni di Rap1, SIR3/SIR4 in lievito. Anse e domini cromatinici. Matrice nucleare e sequenze MAR/SAR. Cenni su altri elementi di controllo: "silencer", LCR, scs, metilazione del DNA, isole di DNA ricche in CpG, etc. Cenni di topologia del DNA e meccanismo delle DNA topoisomerasi.

Organizzazione del genoma eucariotico.

Contenuto di DNA e paradosso del valore di C. Cinetiche di rinaturazione degli acidi nucleici: Cot e Rot. Significato del valore Cot1/2. Geni espressi e geni "housekeeping". Sequenze altamente e moderatamente ripetute.

Organizzazione del gene eucariotico.

Definizione di gene e dimensioni. Geni interrotti, esoni ed introni. Conservazione della struttura del gene. Relazione tra esoni e domini proteici. Rimescolamento degli esoni (exon shuffling) e significato evolutivo. Geni ripetuti e "cluster" genici. Geni degli istoni e degli RNA ribosomali. I geni delle globine e talassemie. Pseudogeni.

Trascrizione negli eucarioti.

Definizione di promotore eucariotico. RNA polimerasi I, II e III: struttura e funzione. Elementi in-cis e fattori di trascrizione per la formazione del complesso di iniziazione. Promotore bipartito della RNA pol I. Promotori della RNA pol II: elemento Inr e TATA box. Promotori della RNA pol III. Funzione di TBP e TFIID. Struttura di TBP e del complesso TBP-DNA. Fattore TFIIH e riparazione preferenziale del filamento stampo.

Regolazione dell’espressione genica negli eucarioti.

Definizione di enhancer. Fattori di trascrizione: generali, "upstream" ed inducibili. Struttura modulare di promotori, enhancers e proteine. Gratuita' chimica dei circuiti di regolazione molecolare. Meccanismo di attivazione della trascrizione. Circuiti di regolazione positivi e negativi. Elementi responsivi: esempi CAAT e GC boxes, Octamer. Domini proteici dei fattori di trascrizione. Fattori di trascrizione e promotori chimerici. Domini di interazione con il DNA: "zinc finger"; omeodomini; "helix-turn-helix" e "helix-loop-helix". Superfamiglia dei recettori stereoidei e dell' acido retinoico. Il fattore di trascrizione Gal4 di lievito: struttura del complezzo con il DNA. Eterodimerizzazioni e associazioni combinatoriali dei fattori di trascrizione. Nucleosomi e regolazione della trascrizione.

Maturazione dei trascritti ed attivita' catalitiche di RNA.

Definizione di maturazione. Trascritti primari ed hnRNA. Classificazione degli introni. Meccanismo di splicing ed elementi in-cis degli introni degli mRNA. Piccoli RNA e strutture ribonucleoproteiche dello spliceosoma. Regolazione dell'espressione genica per splicing alternativo. Splicing degli introni dei geni dei tRNA. Splicing degli introni del II gruppo. Strutture secondarie e autosplicing. Autosplicing degli introni del I gruppo: funzione del cofattore G e meccanismo. Attivita' catalitiche degli RNA. Ribozimi. Degradazione dei trascritti e maturazione dei terminali 5' e 3'. Segnali di degradazione e di poliadenilazione. Ruolo della catena di adenine. RNA editing.

DNA mobile e riarrangiamenti del DNA.

Retrovirus e meccanismo di integrazione. Trasposoni eucariotici. Meccanismi di integrazione. LTR e non-LTR retrotrasposoni. Sequenze LINES, ALU e pseudogeni maturati. Meccanismi di retrotrasposizione autonoma e non autonoma. Locus MAT e determinazione del sesso in lievito: trascritti a- e a-dipendenti.. Loci HML e HMR: meccanismo di riarrangiamento di MAT.

Metodologie del DNA ricombinante.

cDNA e trascrittasi inversa. Clonare un cDNA: plasmidi, fagi e "shuttle vectors". Vettori di espressione. Librerie genomiche e di cDNA. Screening di librerie. PCR ed enzimi termostabili. Metodi di studio di promotori e delle interazioni DNA/proteine. Uso di geni "reporter" e "CAT assay".

Testo consigliato:

B. LEWIN, Genes VII, Oxford University Press (inglese).

B. LEWIN, Gene VI, Zanichelli (italiano).

Afferenza del docente: Dipartimento di Biochimica "G. Moruzzi", via S. Giacomo 11, Bologna.

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