Il genoma eucariotico. Il valore C. Paradosso del valore C. Cinetiche di rinaturazione di sequenze di acidi nucleici denaturati: i valori Cot e Rot. Sequenze di DNA uniche, moderatamente e altamente ripetitive.

Il gene eucariotico. Geni interrotti, esoni e introni. Conservazione della struttura del gene in specie correlate. Corrispondenza tra esoni e domini proteici. Rimescolamento degli esoni (exon shuffling). Tecniche di mappatura con nucleasi S1 e di elongazione dell'innesco (primer extension).

Tecniche di clonaggio e di analisi di frammenti di DNA. Vettori di clonaggio: plasmidi, fagi e cosmidi. Clonaggio di DNA mediante uso di enzimi di restrizione. Clonaggio mediante code di poliA e adattatori (linkers). Tecniche di trasferimento di acidi nucleici su filtro: Southern e Northern blotting. Trasferimento di colonie batteriche e placche fagiche su filtro. Ibridazione su filtro con sonde di DNA radioattive. Costruzione di genoteche. Preparazione e purificazione di RNA messaggero. Trascrittasi inversa e DNA complementare. Clonaggio di DNA genomico parzialmente digerito con enzimi di restrizione. Reazione a catena della polimerasi (polymerase chain reaction, PCR).

Ridondanza genica. Geni ripetuti: geni degli istoni e degli RNA ribosomali. "Clusters" di geni.Famiglie geniche: i geni della globina. Superfamiglie geniche. Riarrangiamenti genici per crossingover ineguale. Pseudogeni e pseudogeni maturati. Sequenze Alu.

DNA satellite e sua organizzazione. Minisatelliti.

Genomi extranucleari: DNA dei mitocondri e cloroplasti.

Organizzazione strutturale del materiale genetico. Condensazione genomi virali e fagici. Il nucleoide batterico. Il genoma eucariotico: cromatina metafasica ed interfasica. Eucromatina ed eterocromatina. Sequenze di DNA connesse alla matrice nucleare (sequenze MAR). Nucleosomi. Struttura dei nucleosomi. Istoni e acetilazione degli istoni. Siti di ipersensibilità alla DNAasi. Metilazione del DNA ed espressione genica. Isole di DNA ricche in CpG.

Trascrizione in eucarioti. Definizione di promotore. Promotori trascritti da polimerasi I e III: formazione del complesso trascrizionale. Promotori trascritti da polimerasi II: sequenza Inr, TATA box e formazione del complesso trascrizionale di base.

Regolazione della trascrizione. Sequenze regolatrici a monte del punto di inizio di trascrizione: CAAT box, GC box e Oct sequence. Gli enhancer. Fattori trascrizionali. Definizione di promotori ubiquitari e tessuto-specifici, costitutivi e inducibili. Approcci e tecniche per lo studio di sequenze di DNA che regolano la trascrizione. Uso di geni "reporter": il gene batterico cloramfenicolo acetil transferasi (CAT). Analisi di promotori per delezioni con esonucleasi III e per inserzione di adattatori (linker scanning mutagenesis). Identificazione di sequenze di DNA che legano fattori trascrizionali: "footprinting" da DNAasi I e saggio di variazione di mobilità su gel (mobility shift assay).

Struttura dei fattori trascrizionali. Domini di legame al DNA e domini attivatori della trascrizione. Il fattore Gal4 in lievito. Motivi strutturali in fattori trascrizionali. "Zinc-finger" e recettori steroidei. "Helix-turn-helix" e omeodomini. "Helix-loop-helix". "Leucine zipper".

Terminazione della trascrizione da polimerasi I, II e III.

Splicing di RNA nucleari che codificano per proteine. Sequenze consenso alle giunzioni introne/esone. Formazione del complesso di splicing: ruolo degli snRNA. Splicing alternativo. Trans-splicing. Splicing tRNA. Splicing introni tipo I e tipo II. Ribozimi. Sequenze introniche codificanti per proteine. RNA editing.

Mutagenesi del DNA. Mutagenesi chimica casuale. Mutagenesi di una "cassetta" di DNA. Mutagenesi sito specifica. Mutagenesi mediante PCR.

Espressione di proteine eterologhe. Vettori di espressione per E. coli e promotori inducibili. Proteine di fusione. Espressione di proteine in lievito. Vettori episomali e di integrazione. Cenni su espressione in cellule di insetto e di mammifero e sull’uso delle linee cellulari CHO e COS. Cenni su espressione in animali transgenici.

Minipreparazioni di DNA plasmidico.

.TESTI CONSIGLIATI

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Recombinant DNA (Watson, Gilman, Witkowski e Zoller)