• immobilizzazione delle proteine su fase stazionaria
• cromatografia di spiazzamento (competitiva, cooperativa, anticooperativa, non-competitiva)
• determinazione della percentuale di legame di ligandi alla proteina immobilizzata
• identificazione dei siti di legame
• determinazione delle costanti di affinità
• interazione fra farmaci
• separazione enantioselettiva di farmaci chirali su fasi stazionarie proteiche

Cinetica enzimatica

• l’acetilcolinesterasi come enzima target
• inibitori enzimatici come potenziali farmaci
• determinazione delle costanti cinetiche : k_m, V_max, k_i
• determinazione dell’IC₅₀ come parametro per la definizione della potenza inibitoria
• calcolo della k_i: grafici di Lineweaver and Burk, definizione del meccanismo d’azione degli inibitori dell’acetilcolinesterasi
• classificazione degli inibitori enzimatici: non covalenti, covalenti, competitivi, non competitivi, di tipo misto

• criteri per la scelta e lo sviluppo dei metodi di analisi per polipeptidi, proteine ed acidi nucleici (metodi separativi diretti cromatografici (HPLC), tramite elettroforesi capillare (CE) e non separativi: analisi della mappa triptica, analisi della sequenza proteica, analisi aminoacidica, metodo assoluto e relativo del contenuto proteico)
• controllo di qualità del farmaco biotecnologico: metodi qualitativi e metodi quantitativi per la caratterizzazione, la stabilità e il calcolo della purezza.
• procedure di purificazione di proteine da colture cellulari : scelta dei metodi separativi.
• analisi di frammenti di DNA e oligonucleotidi mediante cromatografia liquida

• accuratezza, precisione, ripetibilità (precisione intermedia, riproducibilità, specificità) limite di rivelabilità, limite di quantificazione, linearità, campo di applicazione, robustezza.
• calibrazione mediante standard esterno
• calibrazione mediante standard interno
• metodo della normalizzazione dei picchi
• analisi quantitativa di impurezze : metodo dell’aggiunta dello standard

• HPLC-DAD: calcolo della purezza di farmaci polipeptidici
• HPLC-MS: analisi quantitativa SIM e TIC, calcolo del peso molecolare di proteine e biopolimeri

• determinazione dell’eccesso enantiomerico di farmaci chirali
• fasi stazionarie chirali (di tipo Pirkle, derivate dalla cellulosa, a base di ciclodestrine, a scambio di ligando, proteiche) e meccanismi di discriminazione chirale
• derivatizzazione chirale pre-colonna
• uso dei selettori chirali in CE ( ciclodestrine, proteine, saccaridi e mucopolisaccaridi, etc.)

Esercitazioni pratiche

• Ottimizzazione della separazione di una miscela di amminoacidi derivatizzati con HPLC tramite studio delle variabili pH e percentuale di solvente organico; confronto con cromatografia elettrocinetica micellare ( MEKC).
• Determinazione quantitativa degli amminoacidi in miscela tramite HPLC con metodo dello standard esterno.
• Determinazione dell’eccesso enantiomerico di farmaci chirali tramite HPLC con fase stazionaria chirale e tramite CE con impiego di diversi selettori chirali.
• Separazione tramite elettroforesi capillare zonale di farmaci proteici e peptidici
• Biocromatografia: studio delle interazioni farmaco -proteina e farmaco-farmaco su albumina umana immobilizzata
• Determinazione dell’attività catalitica dell’acetilcolinesterasi: calcolo della k_m e V_max
• Determinazione dell’IC₅₀ di inibitori dell’acetilcolinesterasi (Tacrina)

TESTI CONSIGLIATI:

I.W.Wainer, Drug stereochemistry: analytical methods and pharmacology, M. Dekker, 1997 (capitoli 4,6,12).

C.M.Riley, T.WRosanske, Development and validation of analytical methods, Pergamon, 1996 (capitoli 2, 9)

E.Katz, Quantitative analysis using chromatographic tecniques, John Wiley and Sons, 1987

(capitolo 7)

G.W.Fong, S.K.Lam, HPLC in the pharmaceutical industry, M. Dekker, 1991 (capitoli 6,11)

L.Huber, S.A.George, Diode Array Detection in HPLC, M. Dekker, 1993 (capitolo 9)

European Pharmacopoeia , 3rd edition, 1997.

Afferenza: Dip. di Scienze Farmaceutiche, Via Belmeloro 6

Orario ricevimento studenti: tutti i giorni, previo appuntamento